La ingeniería genética en bacterias es una disciplina fundamental en la biotecnología moderna, que permite la manipulación precisa del material genético de estos microorganismos para obtener mutantes con características específicas. En el contexto del avance científico y tecnológico actual, el diseño y la creación de mutantes bacterianos son herramientas poderosas para investigar la función de genes, desarrollar nuevas terapias y producir compuestos de interés biotecnológico.
Este curso proporcionará a los participantes una comprensión profunda de los principios fundamentales y las técnicas avanzadas de ingeniería genética aplicadas a bacterias. Desde los conceptos básicos de la manipulación genética hasta las estrategias más avanzadas de diseño de mutantes, los estudiantes explorarán una variedad de temas clave en este campo emocionante y en constante evolución.

Módulo 1. (Dra. Selene García Reyes) (6 horas)
Tema 1: Introducción a la manipulación genética en bacterias
1.1. Fundamentos e importancia de la manipulación genética en la generación de mutantes.
1.2. Selección del gen a mutar ¿Qué fenotipo estoy buscando estudiar?
1.3. Tipos de mutaciones.
1.3.1. Mutaciones dirigidas por PCR: mutaciones puntuales, deleciones e inserciones.

Módulo 2 Dra. Selene García Reyes (3 horas) y Mtro. Misael Josafat Fabián Del Olmo (3 horas)
1.3.2. Mutagénesis por recombinación homóloga:
• Uso de CRISPR-Cas9
• Uso de técnica de PCR overlaping.

Módulo 3 (Dra. Selene García Reyes) (6 horas)
1.3.3. Métodos químicos, físicos y biológicos para inducir mutaciones.
1.3.4. Mutaciones por inserción de transposones (librerías genómicas).

Módulo 4 (Dra. Selene García Reyes)(6 horas)
Tema 2: Métodos de transformación y preservación bacteriana.
2.1. Técnicas de transformación bacteriana ¿cuál elegir de acuerdo con mi bacteria de interés?
2.1.1. Fundamentos de la preparación de células químicamente competentes.
2.1.2. Fundamentos de la preparación de células electrocompetentes.
2.1.3. Fundamentos de la conjugación bacteriana.

Módulo 5 (Dra. Selene García Reyes)(6 horas)
2.2. Selección y mantenimiento de bacterias transformadas.
2.2.1. Manejo de antibióticos para selección ¿Qué antibiótico utilizar y en qué concentración? ¿Cómo se prepara el stock de antibiótico?
2.2.2. ¿Cómo preservar correctamente una bacteria a -80°C? Glicerol vs Medio Gherna de crioconservación.

Módulo 6 (Dra. Selene García Reyes)(6 horas)
Tema 3: Técnicas de PCR y diseño de oligonucleótidos para diferentes tipos de mutantes ejemplos.
3.1. Diseño de oligonucleótidos y PCR para generar una mutante puntual en el gen pqsE involucrado en la producción de metabolitos secundarios de Pseudomonas aeruginosa.
3.1.1. Fundamentos de la PCR inversa, digestión con la enzima de restricción DpnI, fosforilación con enzima y ligación.
3.1.2. Conociendo algunos kits comerciales de mutagénesis.

Módulo 7 (Dra. Selene García Reyes)(6horas)
3.2. Diseño de oligonucleótidos y PCR overlaping para generar una mutante por doble recombinación homologa en Pseudomonas aeruginosa utilizando un plásmido suicida.
3.2.1. Características de un plásmido suicida, ¿Cuáles opciones existen?
3.2.2. Transformación y selección de mutantes ¿Cómo se comprueba la mutación por PCR y fenotipos? ¿Cómo se cura una mutante con el plásmido pFLP2?

Módulo 8 (Dra. Selene García Reyes)(6 horas)
3.3. Mutación aleatoria por transposones.
3.3.1. Características y aplicación del plásmido pBTK24 para Pseudomonas aeruginosa.
3.3.2. Características y aplicación del plásmido pZXL5 para Enterococcus faecium.
3.3.3. Técnicas de selección y cribado de mutantes por transposones.

Módulo 9 (Dr. Luis David Ginez Vázquez) (6 horas)
Tema 4. Construcción de mutantes en E. coli por el método Datsenko y. Wanner.
4.1. Diseño de oligonucleótidos.
4.2. Método de transformación y selección de mutantes.

Módulo 10 (Dra. Estefanía Morales Ruiz) 6 horas, sesiones online por Meet.
Tema 5. Diseño de mutantes en Bacillus subtillis.
5.1. Diseño de oligonucleótidos.
5.2. Métodos de transformación y selección de mutantes.

Módulo 11 (Dra. Selene García Reyes) (6 horas)
Tema 6. Aplicaciones biotecnológicas de bacterias mutantes.
6.1. Sobreproducción de metabolitos secundarios.
6.2. Descubrimiento de nuevos antibióticos.

Módulo 12 (Dra. Selene García Reyes)(6 horas)
6.3. Mutantes bacterianas para la biorremediación ambiental.
6.4. Generación de plataformas seguras mediante mutaciones de genes de virulencia para la producción de metabolitos secundarios.
6.5. Discusión sobre los desafíos y oportunidades en la manipulación genética.

Módulo 13. (Dra. Selene García Reyes)(6 horas)
Tema 7. Practica de PCR overlaping.

Módulo 14 (Dra. Selene García Reyes)(3 horas)
Tema: Exposición de proyecto final realizados durante el curso.
Cada participante contará con 20 min para exponer y justificar la metodología que empleará para realizar la mutante de interés.
Las presentaciones serán calificadas de acuerdo con rúbrica.

•Molecular Cloning a Laboratory Manual 4ta Edición. Descargar PDF: https://www.cshlpress.com/pdf/sample/2013/MC4/MC4FM.pdf
•Pseudomonas aeruginosa Methods and Protocols. Giovanni Bertoni, Silvia Ferrara. Edición 2024. Descargar en PDF: https://link.springer.com/book/10.1007/978- 1-0716-3473-8#bibliographic-information
•Snyder, L.A.S. (2020). Bacterial Genetics and Genomics (1st ed.). Garland Science. https://doi.org/10.1201/9780429293016
•Choi KH, Schweizer HP. An improved method for rapid generation of unmarked Pseudomonas aeruginosa deletion mutants. BMC Microbiol. 2005 May 23;5:30. doi:10.1186/1471-2180-5-30. PMID: 15907219; PMCID: PMC1173109.
•Nelson MD, Fitch DH. Overlap extension PCR: an efficient method for transgene construction. Methods Mol Biol. 2011;772:459-70. doi: 10.1007/978-1-61779-228-1_27. PMID: 22065455.
•Jeyachandran S, Vibhute P, Kumar D, Ragavendran C. Random mutagenesis as a tool for industrial strain improvement for enhanced production of antibiotics: a review. Mol Biol Rep. 2023 Dec 15;51(1):19. doi: 10.1007/s11033-023-08975-4. PMID: 38100064.
•Trouillon J, Sentausa E, Ragno M, Robert-Genthon M, Lory S, Attrée I, Elsen S. Species-specific recruitment of transcription factors dictates toxin expression. Nucleic Acids Res. 2020 Mar 18;48(5):2388-2400. doi: 10.1093/nar/gkz1232. PMID: 31925438; PMCID: PMC7049718.

Los alumnos interesados podrán participar en la elaboración y autoría de un artículo de divulgación científica sobre la importancia del estudio de bacterias para el avance de la ciencia. Este artículo será sometido a una de las revistas de divulgación científica de la UNAM
Aquí se puede revisar la publicación del curso pasado: https://elfaro.cic.unam.mx/como-entrenamos-a-las-bacterias-para-resolver-problemas-globales/